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目前IHC方法可用許多的方法進行檢測，如ABC法、S-P法、CSA法、EnVision法等。可用于標記的酶有HRP、AKP和葡萄糖氧化酶等。zui后可通過酶促反應使其在抗原抗體結(jié)合部位轉(zhuǎn)化為一定顏色的可見沉積物，對抗原進行定位、定量分析。這些轉(zhuǎn)化物可根據(jù)底物不同，產(chǎn)生不同的顏色，如NBT／BCIP為紫藍色，AEC／H202為紅色，DAB／H202為棕褐色等。而另一種酶促反應可產(chǎn)生一種能在一定波長光照射下生成各種明亮熒光，使IHC敏感性大大提高。Larison等（1995）較早報道了熒光發(fā)生素—磷酸酶底物（fluorogenic Phosphate sesubstrate）方法，用于IHC的信號檢測放大。該方法將標記在抗體上的堿磷酸催化酶底物，轉(zhuǎn)化成能產(chǎn)生熒光的基團分子。Larison所用磷酸酶底物為2—（5，—氯—2，—羥苯基）—6—氯—4（3H）—喹吡啉，也稱ELF-97磷酸鹽底物，并檢測冰凍切片——石斑魚視黃醛組織內(nèi)的多種抗原成分。其操作流程如下。

（1）常規(guī)石斑魚視黃醛組織冰凍切片16t~m厚，經(jīng)固定，PBS洗。

（2）浸入阻斷液內(nèi)洗30min（阻斷液：30mmol／L Tris鹽、150mmol／L NaCl、1%BSA、0．5％TritonX-IOO，pH7．5）。

（3）滴加適當稀釋特異性一抗，37~C，1h，PBS洗3X3min。

（4）生物素化二抗，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（5）鏈霉親和素—AKP，37~C，30min，PBS洗3X3min。

（6）熒光信號轉(zhuǎn)化：將切片浸入ELF磷酸鹽底物液[ELF磷酸鹽底物液：將3t~mol／L2—（5，—氯—2，—羥苯基）—6—氯—4（3玎）—喹吡啉加入至底物緩沖液（底物緩沖液：10mmol／LTris、200mmol／LNaCl、lmmol／lMgCl、0．1mmol／lZnCl2和0．1％二甲亞砜）內(nèi)]，反應8～12s，快速除去反應底物，用阻斷緩沖液（阻斷緩沖液：150mmol／LTris、lOOmmol／LED—TA、lmmol／L左旋咪唑、0．05％TritonX—100，pH8．0）洗20min，中止反應。

（7）用0．125~mol／LHoechst33342襯染3min，PBS洗，無水甘油封片。熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長為360nm；發(fā)射波長為540nm）。

在熒光顯微鏡下可見ELF底物產(chǎn)生明亮的黃綠色熒光，沉積在抗原抗體結(jié)合部位。Larison等的結(jié)果表明，ELF技術在IHC中的應具有以下特點。

（1）克服組織標本的自發(fā)熒光。ELF—97乙醇沉積物具有180nm以上的Stokes移位，對于組織細胞內(nèi)的自發(fā)熒光位移小的特點，可以有效克服這種缺點。另外，ELF沉積物的熒光信號強度和持續(xù)發(fā)光時間要較其他標記二抗的熒光發(fā)光高500倍，也可以有效地避開自發(fā)熒光的影響。

（2）具有較好的穩(wěn)定性。ELF-97磷酸鹽染色的固定標本可保存數(shù)月或數(shù)年，很少出現(xiàn)熒光信號的損失。

（3）可用于免疫熒光組織化學的多重標記。ELF產(chǎn)生的亮綠色熒光可與紅色熒光（如Texared、羅丹明、藻紅蛋白）或藍色熒光（例如Hoechst、AMCA和Cascade blue）結(jié)合進行多重標記。

（4）另外，目前分子探針公司已開發(fā)了多種ELF免疫組織化學染色試劑盒和細胞學標記試劑盒。商品化試劑盒提供了一種快速、敏感的檢測組織細胞內(nèi)蛋白質(zhì)和mRNA的方法。